細胞培養知識（二）

無菌操作基本技術
1. 實驗進行前，無菌室及無菌操作臺（laminar flow） 以紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺風扇運轉10 分鐘后，才開始實驗操作。每次操作只處理一株細胞株，且即使培養基相同亦不共享培養基，以避免失誤混淆或細胞間污染。實驗完畢后，將實驗物品帶出工作臺，以70% ethanol 擦拭無菌操作抬面。操作間隔應讓無菌操作臺運轉10 分鐘以上后，再進行下一個細胞株之操作。
2. 無菌操作工作區域應保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暫時放置，其它實驗用品用完即應移出，以利于氣流之流通。實驗用品以70% ethanol 擦拭后才帶入無菌操作臺內。實驗操作應在抬面之中央無菌區域，勿在邊緣之非無菌區域操作。
3. 小心取用無菌之實驗物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實驗。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放置桌面。
4. 工作人員應注意自身之安全，須穿戴實驗衣及手套后才進行實驗。對于來自人類或是病毒感染之細胞株應特別小心操作，并選擇適當等級之無菌操作臺（至少Class II）。操作過程中，應避免引起aerosol 之產生，小心毒性藥品，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳針頭之傷害等。
5. 定期檢測下列項目： 5.1. CO2 鋼瓶之CO2 壓力 5.2. CO2 培養箱之CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染（水盤的水用無菌水，每周更換）。 5.3. 無菌操作臺內之airflow 壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA 過濾膜，預濾網（300小時/預濾網，3000 小時/HEPA）。
6. 水槽可添加消毒劑（Zephrin 1:750），定期更換水槽的水。

實驗用品
1. 種類?
  1.1. 細胞培養實驗用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur pipet 外，其它均為塑料無菌制品。
  1.2. TC 級培養盤表面均有coating 高分子物質以讓細胞吸附，培養容器種類有Tflask,plates, dishes, roller bottle 等，依實驗需要使用。
  1.3. plastic sterile pipet: 1ml, 2ml,5ml, 10ml, 25ml
  1.4. 塑料離心管: 15ml, 50ml，均有2 種不同材質，其中polypropylene （PP） 為不透明材質，polystyrene （PS） 為透明材質，可依實驗需要而選擇適合材質之離心管。
  1.5. glass pastuer pipet: 9 inch，用以抽掉廢棄培養液等。
  1.6. 玻璃血清瓶（Pyrex or Duran glassware）：100ml, 250ml,500ml,1000ml
2. 清洗? 2.1. 新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡數小時，洗凈后才開始使用。 2.2. 用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。
3. 滅菌?
  3.1. 實驗用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘，置于oven 中烘干。
  3.2. 實驗用玻璃pasteur pipet 以干熱滅菌170℃, 4 小時。  
  3.3. 液體或是固體廢棄物可用10% hypochloride 溶液（次氯酸，即漂白水） 或是蒸汽高壓滅菌121℃, 15 lb, 20 分鐘處理。

培養基
1. 液體培養基貯存于4℃冰箱，避免光照，實驗進行前放在37℃水槽中溫熱。
2. 液體培養基（加血清） 存放期為六個月，期間glutamine 可能會分解，若細胞生長不佳，可以再添加適量glutamine。
3. 粉末培養基配制（以1 升為例）：
  3.1. 細胞培養基通常須添加10% 血清，因此粉末培養基之配制體積為900ml，pH 為7.2 - 7.4。NaHCO3 為另外添加，若將NaHCO3 粉末直接加入液體培養基中會造成pH 之誤差，或局部過堿。因此粉末培養基及NaHCO3 粉末應分別溶解后才混合，然后用CO2 氣體調整pH，而非用強酸（HCl）或強堿（NaOH），因為氯離子對細胞生長可能有影響，且貯存時培養基的pH 易發生改變。   3.2. 材料：
   3.2.1. 純水（milli-Q 水或二次至三次蒸餾水，水品質非常重要）
   3.2.2. 粉末培養基
   3.2.3. NaHCO3 （Sigma S-4019）
   3.2.4. 電磁攪拌器
   3.2.5. 無菌血清瓶
   3.2.6. 0.1 或0.2 mm無菌過濾膜
   3.2.7. pH meter
   3.2.8. 真空幫浦
   3.2.9. CO2 氣體
  3.3. 步驟：
   3.3.1. 取粉末培養基溶于700ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解。
   3.3.2. 稱取適量之NaHCO3 粉末（數量依培養基種類而異，表一）溶于200ml milli-Q 水中，攪拌使其溶解，然后通入CO2 氣體至飽和，約3-5 分鐘。
   3.3.3. 將溶解且含飽和CO2 之NaHCO3 溶液加入溶解之液體培養基中混合?；旌笕芤褐畃H應為7.2-7.4，除非pH 值偏差太大，否則不需用酸堿再調整之。若為太堿，可再通入CO2 氣體調整pH。培養基以真空幫浦通過過濾膜時，pH 會升高0.1-0.2。
   3.3.4. 以0.1 或0.2 mm 無菌過濾膜過濾滅菌，同時分裝至無菌容器中，標示培養基種類、日期、瓶號等，貯存于4℃。（血清亦可加入培養基中一起過濾）
   3.3.5. 配制之培養基配制須作生長試驗與污染測試。
4. 配制培養基之生長測試
4.1. 材料：
4.1.1. MDCK cell （ATCC CCL-34 或CCRC 60004） 4.1.2. 6-well TC plate （or 35 mm TC dish）
4.1.3. methanol
4.1.4. glacial acetic acid
4.1.5. 10% Giemsa solution （GibcoBRL 10092-013）
4.2. 步驟：
4.2.1. 以待測試培養基培養MDCK cell，接種MDCK 細胞于6-well plate （或35mm TC dish） 中，每個well 接種1 × 102 活細胞，同時作對照組實驗。
4.2.2. 接種5～7 天后，在100 倍倒立顯微鏡作觀察細胞群落之生長，待細胞群落大到可以肉眼觀察，而群落間不互相接觸時即可。 4.2.3. 去除培養基，加入1ml Carnoy’s 固定液（甲醇：冰醋酸? 3:1），室溫下靜置10 min。
4.2.4. 去除固定液，水洗二次。
4.2.5. 加入1ml 10% Giemsa solution，，室溫下靜置染色2-3 min。
4.2.6. 去除染液，水洗二次。
4.2.7. 以肉眼計數群落數，并比較之，若新配制或新批號的培養基對細胞生長不佳，則丟棄之。